半定量RT

半定量

RT-PCR

的实验原理和方法步骤

以下实验步骤仅供参考：

1 

样品

RNA

的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置

5

分钟使其完全溶解。

②两相分离

每

1ml

的

TRIZOL

试剂裂解的样品中加入

0.2ml

的氯仿，盖紧管盖。

手动剧烈振荡管体

15

秒后，

15

到

30

℃孵育

2

到

3

分钟。

4

℃下

12000rpm

离心

15

分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上

层。

RNA

全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的

TRIZOL

试

剂的

60%

。

③

RNA

沉淀

将水相上层转移到一干净无

RNA

酶的离心管中。

加等体积异丙醇混

合以沉淀其中的

RNA

，

混匀后

15

到

30

℃孵育

10

分钟后，

于

4

℃下

12000rpm 

离

心

10

分钟。

此时离心前不可见的

RNA

沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④

RNA

清洗

移去上清液，每

1mlTRIZOL

试剂裂解的样品中加入至少

1ml

的

75%

乙醇（

75%

乙醇用

DEPCH

2

O

配制）

，清洗

RNA

沉淀。混匀后，

4

℃下

7000rpm

离

心

5

分钟。

⑤

RNA

干燥

小心吸去大部分乙醇溶液，使

RNA

沉淀在室温空气中干燥

5-10

分

钟。

⑥溶解

RNA

沉淀

溶解

RNA

时，先加入无

RNA

酶的水

40μl

用枪反复吹打几次，

使其完全溶解，获得的

RNA

溶液保存于

-80

℃待用。

2 RNA

质量检测

1

）紫外吸收法测定

先用稀释用的

TE

溶液将分光光度计调零。

然后取少量

RNA

溶液用

TE

稀释

（

1:100

）

后，读取其在分光光度计

260nm

和

280nm

处的吸收值，测定

RNA

溶液

浓度和

纯度。

①

浓度测定

A260

下读值为

1

表示

40 µg RNA/ml

。样品

RNA

浓度

(µg/ml)

计算公式为：

A260 ×

稀释倍数

× 40 µg/ml

。具体计算如下：

RNA

溶于

40 µl DEPC

水中，

取

5ul

，

1:100

稀释至

495µl

的

TE

中，

测得

A260 = 0.21 

RNA 

浓度

= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 

或

0.84 µg/µl 

取

5ul

用来测量以后，剩余样品

RNA

为

35 µl

，剩余

RNA

总量为：

35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg 

②纯度检测

RNA

溶液的

A260/A280

的比值即为

RNA

纯度，比值范围

1.8

到

2.1

。

2

）变性琼脂糖凝胶电泳测定

①制胶

1g

琼脂糖溶于

72ml

水中，冷却至

60

℃，

10 ml

的

10× MOPS

电泳缓冲液和

18 ml

的

37% 

甲醛溶液

(12.3 M)

。

10×MOPS

电泳缓冲液

浓度

成分

0.4M  MOPS

，

pH 7.0 

0.1M  

乙酸钠

0.01M  EDTA 

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入

25 µl

溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板